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病毒RNA提取純化試劑的常規實驗操作

更新日期: 2024-08-27
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病毒RNA提取純化試劑是于血清(血漿)等液體樣品中提取病毒RNA的純化試劑。
實驗操作:
1.如果有N個樣品,標記N+2個1.5-2mL螺旋蓋塑料離心管,多出的一個為陽性對照,一個為陰性對照。為避免污染,建議不要使用壓蓋式塑料離心管。在每個管上做個標記,以在后續操作時區別向心面和離心面。
2.在離心管中分別加入0.2mL液體樣品(血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、眼淚等等),陽性對照和陰性對照。
如果是口腔拭子、咽喉拭子等各種拭子樣品,則將拭子放入0.2mL自備生理鹽水中擠壓出液體,然后取0.2mL進行提取。
如果是糞便等半固定樣品,則取約0.3mL的樣品,加入0.3自備生理鹽水,震蕩重懸,離心取0.2mL上清進行提取。
如果血液,細胞培養液等含細胞的液體,可以離心用上清,也可以直接取用,但后者提取的RNA中有細胞的基因組DNA污染。血漿的抗凝劑必須是EDTA或ACD,不能是肝素。使用ACD時由于所加入ACD會增加體積,樣品會被稀釋,得到的病毒滴度會比使用 EDTA低15%左右。血漿按0.6mL/管的量分裝保存,以避免反復凍融。
如果樣品是實體組織或培養細胞,則需要在自備生理鹽水中勻漿后離心,用0.2mL上清液(含病毒)進行提取,但此種情況下后得到的RNA不可避免的會含有基因組DNA 污染。
如果液體樣品中的病毒需要富集,可以使用1.5mL上述方法得到的液體在4℃24000g 冷凍離心60分鐘,移棄1.3mL、用剩下的0.2mL繼續操作。
3.在每個離心管中加入0.6mL RNA病毒裂解液。RNA病毒裂解液在低溫放置會產生結晶沉淀,需提前65℃水浴溶解并充分搖勻后取用。
4.室溫放置10分鐘裂解病毒。
5.振蕩數秒后加入0.7mL室溫異丙醇,旋緊蓋后振蕩30秒混勻,把離心管的向心面對向轉頭的中央,13000-15000g室溫離心至少15分鐘。
6.小心移棄上清,注意不要觸及管底和管壁離心面的RNA沉淀(此時可能看不見)。
7.加入1.0mL室溫70%乙醇,振蕩數秒后15000g室溫離心5分鐘。注意:在離心機中放置離心管時將其向心面對向轉頭的中央。
8.小心移棄上清,注意不要觸及管底和管壁離心面的RNA沉淀(此時呈膜狀沉淀)。
9.再短暫離心數秒,用移液器移棄殘留液體(70%乙醇),否則它會影響后續反應。
10.加入200μl RNase-free水或1×液相RNase Erasol(能滅活殘留的RNase,而 RNase-free水無此功能),用移液槍仔細吹打離心管管底和管壁離心面的膜狀RNA沉淀,溶液將呈混濁狀,含少量不溶物。由于不溶沉淀物中含有RNA,所以不要離心后取上清使用,必須取混合液使用,哪怕很渾濁。
11.直接取適量用于RT-PCR,如果溶于200uL水,同時樣品使用量不超過RT-PCR體系的 1/2,不溶物一般不會影響RT-PCR。剩余樣品可以室溫放置2小時,也可保存于-80℃保存一個月。 
 
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